Análisis integral de la huella dactilar por HPTLC (Comprehensive HPTLC fingerprinting) para simplificar el control de calidad de drogas y preparados vegetales
El grupo de Farmacognosia y Fitoterapia de la Facultad de Farmacia y Ciencias de la Alimentación de la Universidad de Barcelona, conjuntamente con investigadores de la empresa suiza CAMAG ha publicado recientemente un capítulo de libro (1) y tres artículos (2-5) sobre los avances en la utilización de la cromatografía en capa fina de alta resolución (HPTLC, por sus siglas en inglés, High Performance Thin Layer Chromatograpy) en el control de calidad de drogas vegetales, preparados vegetales y productos a base de plantas medicinales. Además, establecen un nuevo concepto, el “análisis integral de la huella dactilar por HPTLC” (comprehensive HPTLC fingerprinting, en inglés) como herramienta que permite simplificar el control de calidad de los mismos.
En dos revisiones, una en un capítulo de libro de Open Access (1) y otra en español, en la revista Pharmatech, de AEFI (Asociación Española de Farmacéuticos de la Industria) (3), exponen las bases que han permitido desarrollar este nuevo concepto. La cromatografía de capa fina de alta resolución (HPTLC) es una técnica cromatográfica planar que resulta de la evolución de la CCF clásica. Comparte sus principios físico-químicos básicos, así como ventajas tales como resultados visuales, análisis paralelo de muestras, placas cromatográficas de un solo uso, resultados rápidos, flexibilidad en el desarrollo de métodos y la posibilidad de detección múltiple. La HPTLC, sin embargo, en comparación con la CCF, utiliza fase estacionaria con un tamaño de partícula menor, consume menos disolvente, tiene una elución más rápida y es más sensible. La HPTLC usa métodos optimizados, normalizados y validados, con protocolos detallados que incorporan prueba de idoneidad del sistema (SST, system suitability test). Todo ello permite obtener resultados analíticos fiables con una buena reproducibilidad intra- e inter-laboratorio y hace de la HPTLC una técnica compatible con normas GMP. La instrumentación de HPTLC disponible actualmente facilita en gran manera la ejecución de métodos con un buen control de los parámetros implicados.
De acuerdo con lo anterior, en los últimos años, tanto en la Farmacopea Europea (Ph. Eur.) como en la Farmacopea de los Estados Unidos de América (USP) han introducido el uso sistemático y normalizado de la HPTLC, incluyendo la implementación de SST, en la identificación de drogas y preparados vegetales, así como en el control de posibles adulteraciones. La Ph. Eur., además, ha introducido la utilización de una de las sustancias de referencia como marcador de intensidad para mejorar la descripción de los cromatogramas, así como la publicación de fotografías de cromatogramas en color (no en la propia farmacopea sino en su Knowledge database) para ayudar a la interpretación de los cromatogramas.
Esta normalización metodológica actualmente incorporada a las principales Farmacopeas ofrece la reproducibilidad necesaria que permite, con el software adecuado, la explotación de la información cuantitativa, basada en la intensidad de las bandas, contenida en las imágenes digitales de los cromatogramas. Esta información puede ser utilizada para la realización de ensayos límite (por ejemplo, para adulterantes), la determinación de contenido de principios activos o marcadores, o el desarrollo de otros parámetros de calidad que necesiten datos cuantitativos. Se puede acceder a esta información cuantitativa mediante la conversión de las huellas dactilares de HPTLC (imágenes digitales) en perfiles de picos a partir de imágenes (PPI) mediante el cálculo de la luminancia de la media de píxeles RGB de cada línea de la pista y su representación frente a los valores de RF. La altura del pico puede utilizarse como medida de la intensidad y compararse con el pico correspondiente del material de referencia, siendo mucho más objetivo que la simple comparación visual de intensidades de las bandas.
Esto ha dado lugar a un nuevo concepto, el “análisis integral de la huella dactilar por HPTLC”, que permite la simplificación del proceso de control de calidad ya que un único análisis por HPTLC permite obtener información completa sobre la calidad: identidad, posibles adulteraciones y/o riqueza.
Este concepto fue introducido por primera vez en uno de los artículos reseñados (4), en el que además del grupo de Barcelona y los investigadores suizos participaron también diversos grupos asiáticos, particularmente de Corea y Vietnam. En él se desarrolla la prueba del concepto con un estudio sobre el control de calidad de la raíz de Angelica gigas Nakai, conocida como dang gui y de uso común en la República de Corea. La aplicación del análisis integral de la huella dactilar por HPTLC a esta droga vegetal permite, en un solo análisis por HPTLC, obtener información sobre la identidad de la droga vegetal (observación visual), discriminarla de posibles adulterantes, como las raíces de Angelica sinensis y de A. acutiloba (análisis de PPI) y determinar el cumplimiento del contenido mínimo de marcadores (suma de decursina y angelato de decursinilo; también mediante análisis del PPI).
Otro ejemplo, en el que el uso del análisis integral de la huella dactilar por HPTLC puede reducir el número de análisis necesarios para el control de calidad, es el extracto seco refinado de la hoja de ginkgo (Ginkgo biloba L.) se expone en la última publicación reseñada (5), en la que también ha colaborado un grupo de la UCL (Univerity College London). La monografía de la USP prescribe una identificación por HPTLC observando la huella dactilar cromatográfica de flavonoides, y una valoración cuantitativa por HPLC de flavonoides, realizada sobre los aglicones (quercetina, kempferol e isoramnetina) liberados por la hidrólisis de la muestra. El contenido de flavonoides requerido es del 22-27%. El extracto puede ser adulterado con flavonoides puros (por ejemplo, quercetina y rutina) u otros extractos vegetales ricos en heterósidos de quercetina, que liberarán ésta por hidrólisis (por ejemplo, extractos de trigo sarraceno o de flor o fruto de sófora). El objetivo de la adulteración es dar el mismo contenido de flavonoides usando menos extracto de hoja de ginkgo. Por esta razón, la USP incluye un ensayo límite para la rutina y la quercetina por HPLC.
El análisis integral de la huella dactilar por HPTLC aplicado a los productos de ginkgo es capaz de, en un solo análisis:
- Comprobar la identidad del extracto contenido en el producto (evaluación visual).
- Detectar adulteraciones con materiales ricos en quercetina y/o en rutina, así como conocer la naturaleza del adulterante (evaluación visual).
- Comprobar el cumplimiento con el ensayo límite de la USP para quercetina y rutina (análisis de los PPIs obtenidos a partir de una única placa cromatográfica aplicando diferentes sistemas de detección). La buena correlación de los resultados por HPTLC con los obtenidos por HPLC en el ensayo límite de la USP permitiría evitar este último, gracias a un mejor aprovechamiento de las huellas dactilares cromatográficas obtenidas en el análisis de identificación por HPTLC.
Referencias bibliográficas
1. Cañigueral S, Frommenwiler DA, Reich E, Vila R. High performance thin-layer chromatography (HPTLC) in the quality control of herbal products. In: Muñoz-Torrero D, Cajal Y, Llobet JM (Eds.). Recent Advances in Pharmaceutical Sciences VIII. Chapter 7. Trivandrum: Research Signpost; 2018: 119-136. http://diposit.ub.edu/dspace/bitstream/2445/128132/1/T_1548757317munoz%207.pdf
2. Cañigueral S, Vila R, Frommenwiler DA, Reich E. Nuevas aportaciones de la HPTLC en el control de calidad de los productos a base de plantas medicinales. Pharmatech, 41: 52-58. 2019.
3. Frommenwiler DA, Kim J, Chang-Soo Y, Trang Tan TT, Cañigueral S, Reich E. Comprehensive HPTLC fingerprinting for quality control of an herbal drug - the case of Angelica gigas root. Planta Med, 84(6-7): 465-474. 2018.
4. Cañigueral S, Vila R, Frommenwiler DA, Reich E. Nuevas aportaciones de la HPTLC en el control de calidad de los productos a base de plantas medicinales. Pharmatech, 41: 52-58. 2019.
5. Frommenwiler DA, Booker A, Vila R, Heinrich M, Reich E, Cañigueral S. Comprehensive HPTLC fingerprinting as a tool for a simplified analysis of purity of ginkgo products. Journal of Ethnopharmacology 243 (2019) 112084.